Корзина
Выбрано
12.11.2021
Серологические реакции изучают взаимосвязь антигенов с антителами в плазме крови, лишенной фибриногена. После введения антигена вырабатываются специфические антитела, что является ответной реакцией иммунной системы организма. Термин «серология» переводится с латинского языка как изучение сыворотки и ее особенностей.
Серологические методы классифицируются по способу выявления определенного класса иммуноглобулинов. Для выявления антител класса M применяют реакцию агглютинации, что не очень эффективно для lgG-антител. В основу реакции связывания комплемента заложены бактерилиза и гемолиза. Для проявления этих явлений необходимо участие комплемента. Иммуноглобулины класса А и Е не присоединяют комплемент, поэтому использование РСК нецелесообразно для данных антител. Реакция нейтрализации вирусов выявляет способность вируснейтрализующих антител препятствовать инфекционным, гемагглютинирующим, цитопатическим и прочим вирусам. В процессе участвуют антитела, действие которых направлено против эпитопов полноценных вирусных частиц, связанных с их возникновением. В отличие от других методов, иммунологические реакции обладают высокой чувствительностью. Например, при проведении радиоиммунного и иммуноферментного анализов можно определить количественное содержание белка в нг (нанограмм) или пг (пикограмм).
Указанные методы эффективны также при определении группы крови или ее безопасности, проверке на наличие/отсутствие вируса иммунодефицита человека или гепатита В. Иммунологические исследования необходимы для выявления сочетаемости тканей и внутренних органов перед трансплантацией, или тестирования способов подавления при их несовместимости. Чтобы определить специфичность белка по виду и реакцию агглютинации, целесообразно применение реакции Кастеллани.
Лабораторная диагностика подразумевает применение иммунологических методов. Для установки этиологии болезни сравнивают количественные показатели антител в плазме выздоравливающего с пробой, которая была взята в первые несколько суток болезни. Подобные исследования помогают изучить коллективный иммунитет к вирусам и бактериям массового распространения, оценить эффективность профилактических мер в виде прививок.
Моноклональные антитела, продуцируемые гибридной клеточной линией, которая получена при слиянии макрофагов и В-лимфоцитов, с множественной миеломой мышей, что привело к развитию иммунологических методов. Для моноклональных иммуноглобулинов характерно наличие антител химически однородной популяции, соответствующих определенной детерминанте, что позволяет дифференцировать белки. Процесс развития иммунологических исследований сопровождается не только совершенствованием химических реагентов, но и автоматизацией постановок реакций, инструментальных проверок приборов учета.
Виды серологических реакций
По механизму и способам учета, выделяют пять основных видов реакций.
Реакция агглютинации
По постановке реакция является наиболее простой, и представляет собой процесс связывания корпускул (бактерии, эритроциты и прочие клетки, нерастворимых частиц) антителами. Взвесь каждого тест-штамма добавляется к разведенной сыворотке крови, а при достижении температуры 37 градусов по истечении определенного времени контактирования, регистрируются условия, необходимые для агглютинации. Реакция агглютинации подходит для диагностирования некоторых заболеваний инфекционного типа. Например, бруцеллез (вызывается бактериями рода бруцелл, передается человеку от животного), туляремия (фебрильная болезнь), брюшной и сыпной тифы, шигеллёз (разновидность дизентерии).
Определение группы крови и резуса-фактора по РА основывается на взаимосвязи антител, вырабатываемых, как следствие иммунного стимула и структурных образований на мембранной поверхности эритроцитов. Антирезусные антитела неполные, не обладают способностью напрямую вступать в реакцию с эритроцитами резус-положительного типа. В подобных случаях целесообразно применение реакции Кумбса, которая основана на обнаружении антител, не способных образовать макромолекулярную систему, различимую на глаз с использованием антиглобулиновой сыворотки.
Сыворотка крови, которую необходимо исследовать добавляется к эритроцитам с известной специфичностью, после чего следует антиглобулиновая сыворотка против иммуноглобулинов класса G. Метод непрямой реакции Кумбса. Участок связывания антигена неполных антител, содержащихся в сыворотке, соединяется с эритроцитами, а антитела иммуноглобулинов класса G присоединяются к свободным кристаллизующимся фрагментам иммуноглобулина (fragment crystallizable region). Таким образом происходит процесс агглютинации красных кровяных клеток.
Различают прямую агглютинацию и непрямую реакцию гемагглютинации. В первом случае иммуноглобулины выявляются в сыворотке пациента путем добавления взвеси бактерий. В результате образуется хлопьевидный осадок, что означает положительную реакцию склеивания. Подобным образом выявляется брюшной острые инфекционные заболевания, паратиф и другие.
В основе РПГА лежит применение красных кровяных тельцов или синтетических материалов нейтрального характера и антигенов, которые адсорбированы на поверхности. Биологическая сенсибилизация эритроцитов антигенами называется диагностикум эритроцитарный. Служит для выявления и количественного определения белков. Сенсибилизация эритроцитов иммуноглобулинами определяется как диагностикумы иммуноглобулиновые эритроцитарные, используемые для определения и вычисления количества антигенов. При связывании с сывороткой пациента, образуется фестончатый осадок.
Реакция пассивной гемагглютинации позволяет диагностировать болезни от вирусов и бактерий. К бактериальным можно отнести брюшной тиф, паратифозные болезни, шигеллез и т.д. К вирусным – грипп, аденовирусы, желтуха и другие. Также с помощью непрямой гемагглютинации выявляется повышенная чувствительность организма к активным веществам, вырабатываемым эндокринной системой и лекарственным средствам.
Суть реакции торможения гемагглютинации заключается в том, нейтрализация вирусов происходит за счет иммуноглобулинов сыворотки. В результате последние уже не способны связывать эритроциты. Позволяет распознавать этиологическую сущность вирусных заболеваний и возбудителей, обладающих гемагглютинирующими качествами. Для диагностирования клещевого менингоэнцефалита, в лунку на посадочной панели наливают сыворотку пациента, разведенную боратным буферным раствором. Далее добавляется вирусный антиген. Спустя 18 часов при температуре в 4 градуса вводится взвесь эритроцитов крови гусей, которая была приготовлена в кислотной среде. При наличии антител происходит нейтрализация антигена, а также исключена вероятность агглютинации эритроцитов. Другой разновидностью РА является реакция коагглютинации. Для выявления антигена используют бактерии стафилококка, которые обработаны иммунной сывороткой.
Реакции преципитации
Растворимый молекулярный антиген взаимодействует с антителами, что становится причиной процесса преципитации. В качестве примера можно отметить непрозрачную полоску в трубке (помутнение, называемое преципитат). Во время смешивания должны соблюдаться эквивалентные пропорции, в противном случае снижается уровень появления иммунного комплекса. Широкое применение реакции преципитации нашли для агаровых гелей полужидкой консистенции, или для линейного полисахарида, получаемого из агара, носящих единые показатели. Преципитаты в виде белой полосы различаются в неизмененном препарате, однако, для лучшего визуального выявления их окрашивают. Они располагаются в зоне оптимальной концентрации антигена и антител. Главная особенность заключается в образовании индивидуальной полосы для каждой пары. На их образование требуется несколько дней при температуре 4 градуса в камере с определенной влажностью. Наличие прочих антиген и антител не влияет на реакцию.
Для идентифицирования, количественного определения антител и антигенов применяют двойную иммунодиффузию Оухтерлони. Растопленный гель наливается на поверхность стеклянной пластинки до полного затвердевания. Затем вырезаются 1,5–3х мм лунки. В лунки, которые расположены по окружности помещаются антигены для исследования, а ту, что расположена в центре – иммунная сыворотка с известной специфичностью. В результате диффузии сыворотки, полученной из сыворотки иммунизированных/переболевших людей и антигенов, образуется преципитат.
Радиальная иммунодиффузия (метод Манчини) предполагает введение иммунной сыворотки в агар. Антиген в лунках проникает через агар, после чего происходит преципитация с сывороткой. Вокруг лунок появляется осадок в виде непрозрачных колец с диаметром, пропорциональным содержанию антигена. Данный метод используют для определения класса Ig. Противомикробные антитела различных классов Ig выявляются благодаря модификации метода.
Иммуноэлектрофорез сочетает электрофорез и иммунодиффузию. Усиливается миграция антител и антигенов за счет использования электрического поля для реагентов на пластине. В зависимости от подвижности и заряда элементов, происходит разделение на компоненты.
Радиоиммуноэлектрофорез – иммуноэлектрофорез с применением антител с радиоактивной меткой. После разделения антигенов в электрическом поле, наливается иммунизированная сыворотка, меченная I-131 (радиоактивный йод). Далее вливается сыворотка против G-иммуноглобулинов, преципитирующая образованные системы антиген–антитело (способ авторадиографии). Несвязавшиеся реагенты вымываются.
Реакции с участием комплемента
Суть метода заключается в образовании циркулирующего иммунного комплекса (ЦИК) за счет соответствующих друг другу веществ, к которым присоединяется комплемент через кристаллизующийся фрагмент иммуноглобулина. Комплементом выступает свежая сыворотка крови морской свинки, со способностью субкомпонента Clq (составляющая С1) и прочих составляющих входить в иммунную систему.
РСК способствует выявлению титра раствора, в зависимости от степени фиксации составляющей системы антиген–антитело. Во время реакции происходят две стадии:
Сыворотка взаимодействует с антигеном.
Гемолитическая сыворотка взаимодействует с красными кровяными тельцами.
Положительная реакция сопровождается присоединением комплемента. При введении иммуноглобулиновых эритроцитарных диагностикумов не происходит разрушение эритроцитов в плазме крови. Подобный вид серологического исследования позволяет диагностировать RW, вирусные заболевания и прочие бактерии.
Течение реакции радиального гемолиза (РРГ) возможно в геле из агара. Суспензия эритроцитов барана помещается в пористый инертный материал с комплементом. Лунки делаются на слое, который уже застыл. Далее вводится гемолизин. Образование гемолизинов и зоны гемолиза вокруг лунки являются важными признаками диагностики. Чтобы определить гемолитическую активность, поверхность с бактериологическим посевом просматривается против света. Если на эритроцитах происходит поглощение гомотримерного гликопротеина, обнаруживаемого на поверхности вируса гриппа и прочих инфекционных заболеваний, то к данным вирусам можно применить иммунный гемолиз. РРГ подходит для выявления вирусной инфекции. К преимуществам метода относятся:
-
простота постановки;
-
возможность использования свежевыделенных штаммов, чувствительных к ингибиторам;
-
определение титра по размеру зон гемолиза без разведения сыворотки;
-
не нужно предварительно обрабатывать исследуемые сыворотки.
Иммунное прилипание (РИП) основано на активировании системы, клетками, пораженными патогеном, которые впоследствии были обработаны сывороткой, иммунизированной определенным антигеном. На поверхности кровяных клеток расположены рецепторы к белку острой фазы воспаления С3. При добавлении к антигену сыворотчных белков и иммунной сыворотки, возникает взаимосвязь антиген–антитело. С3 в свою очередь покрывает структуру. С помощью реакции выявляют клещевой менингоэнцефалит, вирус денге, сопровождающиеся патологическими изменениями иммунной системы и содержанием вируса в крови.
Реакции нейтрализации
Универсальная реакция, применяющаяся при идентификации и серодиагностике вируса. Антитела иммунной системы нейтрализуют определенные функции антигенов (блокада микробов). В иммунологии метод используют для определения АСЛ О, АСК и антистафилолизинов. Биологическая эффективность РН заключается в титровании противостолбнячной и противоботулинических сывороток. Введенный вирус или бактерия не приводят к гибели животных.
Для постановки реакции смешивается частица вируса и сыворотка в равных объемах. Далее необходимо выдержать раствор в течение нескольких часов, создав необходимые условия. Полученная смесь вводится в живую систему или клеточную культуру с чувствительностью к вирусу. В случае положительного результата происходит нейтрализация патогенности вируса, не происходит заболевания животных и деструкция структурной единицы.
Применяемые сыворотки предварительно освобождаются от термолабильных ингибиторов их прогреванием. РН возможны в 2-х вариантах:
-
добавление одинаковых доз вируса к разным дозам сыворотки;
-
добавление одинаковых доз сыворотки к разным дозам вируса.
-
РН сопровождается контролем на каждый компонент, что участвует в процессе. Метод отличается универсальностью и высокой специфичностью.
Реакции с использованием химических и физических меток
При проведении иммунофлуоресцентного анализа используются антитела, помеченные флюорохромом или иммуноглобулиновые фракции (lgG). Меченые флюоресцентным красителем антитела образуют комплексы антиген–антитело, доступные для просмотра под микроскопом с ультрафиолетовой лампой, обеспечивающей свечение флуорохрома. Прямой метод иммунофлюоресценции позволяет изучать клеточные антигены, выявлять зараженные клетки вирусом, обнаруживать бактерии и риккетсии в мазке. В случае диагностики рабиеса (бешенство) используется люминесцирующая антирабическая сыворотка, которой обрабатываются отпечатки и мазки с кусочков мозга животного. Признаком положительного результата являются ярко– зеленые глыбки в цитоплазме нейронов. Экспресс-метод диагностирования респираторных вирусных заболеваний и аденовирусов основывается на обнаружении антигена со слизистой носовой полости.
Чаще всего применяется непрямая иммунофлюоресценция, позволяющая выявить комплекс антиген–антитело, с помощью сыворотки от иммуноглобулинов класса G. Можно обнаружить антиген и определить относительную концентрацию белков. Метод эффективен для серологической диагностики герпеса, цитомегаловируса и лихорадки Ласса. Чтобы образовались иммунные комплексы для сыворотки, необходимо поддержание постоянной температуры. Несвязавшиеся реагенты отмываются и выявляются комплексы. Меченые ферментами сыворотки против иммуноглобулинов класса M и G обеспечивают дифференциацию типов, обнаруживают иммунную реакцию на наличие иммуноглобулинов класса М.
В основе иммуноферментных энзим–иммунологических способов исследования лежит использование иммуноглобулинов, которые конъюгированы с ферментом (пероксидаза хрена либо щелочная фосфатаз). Для выявления соединений вводится субстрат, который разлагается после присоединения lgG ферменту. При введении пероксидазы хрена происходит окрашивание в желто–коричневый оттенок, а фосфатазы – желтовато–зеленый. Возможно применение ферментов, разлагающих люмогенные субстраты. Свечение является признаком положительной реакции. Метод позволяет обнаружить клеточные антигены или титровать антитела.
Одним из разновидностей ИФА является иммуносорбция. Антиген сорбируется на целлюлозе, ПАА, полимере глюкозы и различных пластмассах. В качестве носителя выступают лунки микропанели. Исследуемая сыворотка, меченая антисыворотка и субстрат вводятся в сорбированный антиген. В случае положительного результата меняется цвет жидкости. Для того чтобы обнаружить антигены, иммуноглобулины сорбируются на носителе, а после вводят исследуемое вещество. Далее проявляется реакция с применением меченых антител. Реакция авидина и биотина (стрепта–видин) повышает степень чувствительности ИФА и иммунофлюоресцентного анализа.
В основе изотопного иммунологического метода заложено использование радиоизотопной метки. Один из самых чувствительных методов выявления схемы антиген-антитело. Позволяет исследовать белки крови, тканевые антигены. С помощью данного анализа можно определить реакцию гормонов, лекарственных средств и антибиотиков на заболевания различной этиологии. Изначально предназначался для определения уровня гормонов, которые циркулируют в крови. В качестве тестируемой системы выступает антиген с антисывороткой. При введении в антисыворотку материала с необходимым гормоном происходит связывание части антител. Если ввести титрованный гормон произойдет связь иммуноглобулинов с его уменьшенным количеством. Связанные и несвязанные метки помогают определить результат за счет их сопоставления. Метод называется конкурентной реакцией.
Иммуногистологические методы эффективны при определении антигена на или в клетке. При клубочковом нефрите (ГН) и других почечных заболеваниях позволяет обнаружить маркеры лимфоцитов. Выявителями в реакции выступают иммунофлуоресцентный анализ или конъюгат пероксидазы. Специфические антигены и их количество определяет степень окрашивания. Для автоматической регистрации используется спектрофотометр.
Выявление белков способом сочетания электрофореза и ИФА называется иммуноблоттингом. Чтобы выявить антитела к определенным антигенам необходимо разделить антигены возбудителя электрофорезом. Разделенные белки переносятся на блот. Прямая или непрямая иммуноферментная реакция позволят выявить искомые белки.
Рекомендуем к прочтению:
- Иммунохимические исследования крови и биологических жидкостей
Заказать звонок
Возникли вопросы?
Заполните форму обратной связи, наши менеджеры свяжутся с вами!
Задать вопрос
Полезное
Просмотреть все
